| Zusammenfassung: | Die ALA-induzierte PpIX-Fluoreszenz findet aufgrund ihrer geringen Zelltoxizität zunehmende Verbreitung in der Fluoreszenzdiagnostik maligner Prozesse. Es zeichnen sich jedoch immer noch Grenzen diagnostischer Aussagefähigkeit dieser Methode ab. Eine Fluoreszenz-Kontraststeigerung zwischen Tumor und Nichttumor würde die diagnostische Trennschärfe der Methode verbessern. Hinzu kommt, dass die Ursache der ALA- induzierten PpIX- Fluoreszenzsteigerung in Tumoren und die metabolischen Zusammenhänge im Tumor selbst bisher nicht endgültig geklärt sind. Die charakteristischen Merkmale maligner Zellen sind eine hohe Zellteilungsrate und ein verzögerter Zelltod. Die unbeschränkte Proliferation der Tumorzellen führt zu einem Verlust physiologischer Zellfunktionen sowie zu einer persistierenden Aktivierung pathologischer metabolischer Prozesse. Ein Großteil der Tumore besitzt einen geringen Sauerstoffverbrauch, versorgt ihren Energiebedarf überwiegend durch die Glykolyse und verfügt nur über eine reduzierte Atmungsketten-Aktivität. Hierdurch kommt es zu einem verminderten Bedarf an Cytochromen, den Katalysatoren der Atmungkette, und folglich zu einem verminderten Verbrauch ihres Grundbausteins Häm. Ein intrazellulärer Anstieg von Häm führt zu einer Feedback-Inhibition der ALA-Synthase und Ferrochelatase. Durch exogene Zufuhr von ALA wird der ALA-Synthase-katalysierte Schritt umgangen und durch die Inhibition der Ferrochelatase ein vermindertes Abreagieren von PpIX zu HÄM verursacht. Pp IX reichert sich im Gewebe an und kann fluoreszenztechnisch genutzt werden. Der erste Grundbaustein der Häm-Synthese ist Succinyl-CoA, ein Metabolit des Zitratzyklus. Der Zitratzyklus selbst ist anteilsmäßiger Hauptlieferant von Reduktionsäquivalenten für die Atmungskette. Somit stehen Zitratzyklus und Atmungskette mit der Häm- und somit PpIX-Produktion über den Zellstoffwechsel in Verbindung. Der Einfluss metabolischer Zusammenhänge auf die Fluoreszenzantwort wurde durch Modulation (Stimulation und Inhibition) ausgewählter Stoffwechselschritte des Zitrat-Zyklus, der Glykolyse, der Atmungskette und der Porphyrinsynthese untersucht. Voruntersuchungen zur Dosis-Wirkungs-Beziehung und Kinetik der ALA- induzierten PpIX-Fluoreszenz wurden durchgeführt, statistisch verifiziert und die Konzentrationen maximaler Fluoreszenzausbeute und Inkubationszeiten mit Sättigungscharakter bzw. maximaler Fluoreszenzunterscheidung von Tumor und Nichttumor für die Stoffwechseluntersuchungen verwendet. In murinen SSK II-Fibrosarkomzellen und murinen 3T3-Fibroblasten wurde die Autofluoreszenz und ALAinduzierte Pp IX-Fluoreszenz mit dem FACScan-Durchflusszytometer bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und Detektionswellenlänge von 585 nm bestimmt. Die Stoffwechsel-induzierte, insbesondere ALA-induzierte Fluoreszenz wurde zur Steigerung der diagnostischen Trennschärfe auf die Autofluoreszenz bezogen. Anschließend wurde die Tumor-Normalgewebe-Relationen (TNR) berechnet und die Daten statistisch mit dem unverbundenen Rangsummentest nach Mann, Whitney und Wilcoxon verifiziert. Eine signifikante, selektive Autofluoresezenzsteigerung in den SSK II-Zellen zeigten der Glykolysehemmstoff Oxamat und Kalzium durch Aktivierung des Zitratzyklus, sowie Phenantrolin durch Stimulation der Porphyrinsynthese. ATP bewirkte selektiv in den 3T3- Zellen eine signifikante Autofluoreszenzsteigerung durch Feedback-Inhibition der oxidativen Phosphorilierung. Eine Autofluoreszenzhemmung beider Zellinien zeigte Iodoacetat, ein Hemmstoff der aeroben Glykolyse. Die Atmungsketten aktivierenden Nicotinadenide, NAD, NADH, NADP und NADPH, bewirkten eine Autofluoreszenzhemmung in den 3T3-Zellen. Die PpIX-Fluoreszenz beider Zellinien wurde durch die 5-Aminolävulinsäure signifikant gesteigert. Eine selektive PpIX-Fluoreszenzsteigerung in den SSK II-Zellen zeigte der Atmungsketteninhibitor Antimycin A und Ethanol durch Aktivierung der Porphyrinsynthese. Phenantrolin führte durch Steigerung der Porphyrinsynthese in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der ALA-induzierten-Pp IX-Fluoreszenz. Die Nikotinadenide, NAD und NADP, sowie Oxamat und der Atmungskettenaktivator ADP zeigten eine selektive PpIXFluoreszenzhemmung in den Fibroblasten. GTP führte zu einer selektiven ALA-induzierten- Pp IX-Fluoreszenzhemmung in den SSK II-Zellen. Iodoacetat inhibierte in beiden Zellinien die PpIX-Fluoreszenz. Der Bezug der Fluoreszenzdaten auf die Autofluoreszenz führte zu einer deutlichen fluoreszenztechnischen Kontrastverstärkung zwischen Tumorzellen und Fibroblasten. Die diagnostische Trennschärfe zwischen Tumorzellen und Nichtumorzellen konnte unter Zusatz der Nikotinadenide gesteigert werden. Es zeigte sich durch NADH eine im Vergleich zum Nichttumor 7-fache Fluoreszenzsteigerung im Tumor. Mit Hilfe des Autofluoreszenzvergleichs kam es unter Zusatz von NADH zu einer annähernd 10-fachen Tumorfluoreszenz verglichen mit den Fibroblasten. Bezüglich zukünftiger klinischer Anwendungen muss man jedoch die Grenzen der Aussagefähigkeit einer in vitro Studie beachten. Ein weiterer Schritt ist es, Auswirkung der Zellinteraktionen auf das Fluoreszenzverhalten zu untersuchen. Hier gilt es, Wechselwirkungen zwischen Tumor und Normalgewebe im Gewebsverband mitzuberücksichtigen, um Aussagen über die Tumorausdehnung und Detektionsverbesserungen von Tumorrandbereichen treffen zu können. Möglichkeiten bieten hier dreidimensionale Zellverbände, wie z.B. Gewebemodelle auf der Chorion- Allantois- Membran. | |
